前言
氨基酸是生物体中重要的生命物质，是组成酶和蛋白质的基本单元。作为小分子，氨基酸对生物大分子的活性及其生理功能起着极为重要的作用；作为配体，它可与多种金属离子配位，为研究抗肿瘤、抗癌药物提供信息。各种氨基酸在生物体中具有不同的生物功能，因此，准确灵敏地测定食物、药品和生物样品中氨基酸的含量具有十分重要的意义。
本实验采用VenusilR AA氨基酸分析方法包中的检测标准，使用VenusilR AA氨基酸分析专用柱对某植物提取物中的氨基酸组成进行了测试。
实验部分
仪器、试剂与材料
试剂材料
流动相A：称取15.2 g无水醋酸钠，加水1850 mL溶解，用冰醋酸调节pH至6.5，然后加入乙腈140 mL，混匀；
流动相B：乙腈︰水=80︰20；
水解液：6.0 mol/L盐酸溶液(含1%苯酚)；
稀盐酸：0.1 mol/L盐酸；
内标溶液：称取正亮氨酸10 mg，置于10 mL容量瓶中，加稀盐酸溶解并定容至刻度；
三乙胺乙腈溶液：取VenusilR AA氨基酸分析方法包中三乙胺一瓶，加乙腈8.6 mL，混匀；
异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取VenusilR AA氨基酸分析方法包中异硫氰酸苯酯溶液1瓶，加乙腈2.0 mL，混匀；
氨基酸标准溶液：取VenusilR AA氨基酸分析方法包中17种氨基酸标准溶液（包括门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、赖氨酸）1.0 mL，稀盐酸4.0mL稀释，混匀；
某植物提取物样品：黄色粉末，由某药业有限公司提供。
样品水解
分别称取某植物提取物A、B、C各1.0 g，分别置于10.0 mL水解管中，加0.1 mol/L稀盐酸9.0 mL溶解，振摇使样品均匀分散于溶液中。将水解管置110 ± 1 ℃烘箱中水解24小时。取出水解管，冷却至室温，移取水解液1.0 mL，置于10 mL样品瓶中，放入氮吹仪中以50℃氮吹至干，向残渣中加入0.1 mol/L盐酸1.0 mL，超声使充分溶解，用0.45 μm滤膜过滤后，供衍生使用。
氨基酸标准溶液和样品溶液的衍生
取17种氨基酸标准溶液、上述氨基酸水解液样品溶液各200 μL，分别置于1.5 mL离心管中，向每个离心管中加入内标溶液20 μL，混匀，然后依次向每个离心管中加入三乙胺乙腈溶液100 μL，异硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，混匀，室温放置1小时。再向每个离心管中加入400 μL正己烷，振摇后放置10 min，取下层溶液200 μL，加800 μL水稀释，经0.45 μm针筒过滤器过滤，取续滤液作为样品试液。
色谱条件
色谱柱：VenusilR AA；5 μm；4.6 × 250 mm；
流 速：1.0 mL/min；
柱 温：40 ℃；
波 长：254 nm；
进样量：10 μL；
梯 度：
表1.液相色谱梯度洗脱条件
时间/min | A/% | B/% |
0 | 100 | 0 |
2 | 100 | 0 |
15 | 90 | 10 |
25 | 70 | 30 |
33 | 55 | 45 |
33.1 | 0 | 100 |
38 | 0 | 100 |
38.1 | 100 | 0 |
45 | 100 | 0 |
结果与讨论
本实验采用VenusilR AA氨基酸分析方法包对某植物提取物中氨基酸进行了测试，由表2及图2、3、4可知，使用VenusilR AA氨基酸分析方法包共检测出某植物提取物中17种氨基酸。
表2. 某植物提取物中氨基酸含量测试结果
色谱峰序号 | 氨基酸名称 | 氨基酸含量mg/g | ||
某植物提取物A样 | 某植物提取物B样 | 某植物提取物C样 | ||
1 | 门冬氨酸 | 0.0067 | 0.0104 | 0.0080 |
2 | 谷氨酸 | 0.0614 | 0.0662 | 0.0569 |
3 | 丝氨酸 | 0.0072 | 0.0071 | 0.0034 |
4 | 甘氨酸 | 0.0022 | 0.0036 | 0.0025 |
5 | 组氨酸 | 0.0154 | 0.0093 | 0.0052 |
6 | 精氨酸 | 0.0152 | 0.0085 | 0.0157 |
7 | 苏氨酸 | 0.0032 | 0.0036 | 0.0023 |
8 | 丙氨酸 | 0.0124 | 0.0123 | 0.0065 |
9 | 脯氨酸 | 0.0099 | 0.0088 | 0.0058 |
10 | 酪氨酸 | 0.0019 | 0.0024 | 0.0016 |
11 | 缬氨酸 | 0.0051 | 0.0056 | 0.0038 |
12 | 蛋氨酸 | 0.0021 | 0.0029 | 0.0020 |
13 | 胱氨酸 | 0.0004 | 0.0005 | 0.0003 |
14 | 异亮氨酸 | 0.0087 | 0.0087 | 0.0078 |
15 | 亮氨酸 | 0.0059 | 0.0060 | 0.0046 |
16 | 苯丙氨酸 | 0.0017 | 0.0030 | 0.0018 |
17 | 赖氨酸 | 0.0006 | 0.0010 | 0.0007 |
总计 | — | 0.1600 | 0.1599 | 0.1289 |
图1. 18种混合氨基酸对照溶液高效液相色谱图
图2. 某植物提取物A水解液高效液相色谱图
图3. 某植物提取物B水解液高效液相色谱图
图4. 某植物提取物C水解液高效液相色谱图
结论
根据实验结果，使用VenusilR AA氨基酸分析方法包共检测出某植物提取物中17种氨基酸，A、B、C样品中氨基酸总量分别为0.1600 mg/g、0.1599 mg/g、0.1289 mg/g。
附：相关产品
产品名称 | 规格描述 | 包装数量 | 订货号 |
VenusilR AA氨基酸分析方法包 | — | 1 | AA952505-K |
VenusilR AA氨基酸分析专用柱 | 4.6 × 250 mm，5 μm | 1 | AA952505-0 |
异硫氰酸苯酯(PITC) | 25 μL | 10 | AA-D |
氨基酸标准溶液(含17种氨基酸) | 1 mL | 2 | AA-S |
正亮氨酸(Nle) | 100 mg | 1 | AA-I |
三乙胺(TEA) | 1.4 mL | 2 | AA-B |
1.5 mL样品瓶 | 短螺纹透明带书写处 32 × 11.6 mm | 100/PK | 1109-0519 |
1.5 mL样品瓶盖 | 9 mm中心孔蓝盖，红色橡胶/米色PTFE隔垫45°Shore A；1.0 mm | 100/PK | 0915-1819 |
微孔滤膜 | 单膜，13 mm，0.45 μm | 100个/包 | AS021345-T |
一次性注射器 | 2 mL无针头 | 100支/包 | LZSQ-2ML |
乙腈 | 4 L/瓶，色谱纯 | 4×4 L/箱 | AH015-4 |
应用编号：AP10068