前言
抗生素以前被称为抗菌素，事实上它不仅能杀灭细菌而且对霉菌、支原体、衣原体、螺旋体、立克次氏体等其它致病微生物也有良好的抑制和杀灭作用，通常将抗菌素改称为抗生素。抗生素可以是某些微生物生长繁殖过程中产生的一种物质，用于治病的抗生素除由此直接提取外；还有完全用人工合成或部分人工合成的。通俗地讲，抗生素就是用于治疗各种非病毒感染的药物。但是在临床使用中已经显现了许多副作用。大量使用抗生素会带来较强毒副作用，直接伤害身体，尤其是对儿童听力产生伤害。滥用抗生素会使细菌产生耐药性，会大量杀灭人体内正常细菌，使人体正常菌群失调
因此通过有效的实验技术手段，对水中的抗生素进行监控，以确保人们的身体安全具有重要意义。
本实验以抗生素在水中的检测方法为基础，通过优化前处理方法建立了同时确证定量检多种抗生素在水中的高效液相串联质谱方法。
实验部分
仪器、试剂与材料
主要仪器设备
AB SCIEX API 4000+液相质谱联用仪；
试剂材料
乙腈为色谱纯；实验用水为超纯水；
5%氨化甲醇：取5 mL氨水，用甲醇溶解并稀释到100 mL；
0.1%甲酸水溶液：取甲酸0.2 mL，用水溶解并稀释至200 mL；
一次性无菌注射器；针式过滤器(0.22 μm，直径13 mm)；
LDC大体积水处理柱-Cleanert PEP-2：1 g/200 mL
样品制备
样品制备
量取500 mL水样，加入0.25 g EDTA，用盐酸调节pH为4.0，待净化。
样品净化
SPE方法
取Cleanert PEP-2 (500 mg/6 mL)，依次用9 mL甲醇，5 mL水，5 mL 0.1%甲酸水(V/V)溶液活化小柱；将上述待净化液以10 mL/min流速通过SPE固相萃取柱，再用5 mL水淋洗小柱，抽干15 min；最后用10 mL 5%氨化甲醇（V/V）洗脱，收集；45℃氮气吹干洗脱液，用1 mL 20%乙腈水（V/V）溶解定容，取上层清液适量过0.22 μm针式过滤器，供LC/MS/MS检测。
LDC方法
取Cleanert LDC（PEP-2）大体积水专用柱 (1 g/200 mL)，依次用9 mL甲醇，5 mL水，5 mL 0.1%甲酸水(V/V)溶液活化小柱；将上述待净化液以90 mL/min流速通过LDC大体积水专用柱，再用5 mL水淋洗小柱，抽干15 min；最后用20 mL 5%氨化甲醇（V/V）洗脱，收集；45℃氮气吹干洗脱液，用1 mL 20%乙腈水（V/V）溶解定容，取上层清液适量过0.22 μm针式过滤器，供LC/MS/MS检测。
基质混合标准工作溶液配制
取高浓度农药混合标准溶液，用空白样品基质溶液稀释成0.01 μg/mL的基质混合标准工作溶液。
实验条件
液相条件
色谱柱：Venusil MP C18，5 μm，100 ?，2.1 × 150 mm；
流动相：A: 0.1%甲酸水溶液（V/V）；B:乙腈，使用前经微孔滤膜过滤
柱 温：30℃
进样量：10 μL
质谱条件
正离子模式
离子源：ESI+；电喷雾电压：5500 V；雾化气压力：55 psi；气帘气压力：20 psi；辅助气压力：50 psi；离子源温度：650℃；采集方式：多反应监测(MRM)。
梯度洗脱：见表1
表1. 正离子模式液相色谱梯度洗脱条件
时间/min | 流速/(mL/min) | A/% | B/% |
1.00 | 0.30 | 90 | 10 |
3.00 | 0.30 | 40 | 60 |
5.00 | 0.30 | 5 | 95 |
7.00 | 0.30 | 5 | 95 |
8.00 | 0.30 | 90 | 10 |
20.00 | 0.30 | 90 | 10 |
质谱参数：见表2
表2. 13种抗生素质谱参数
物质名称 | Q1 | Q3 | DP/V | CE/V |
红霉素 | 734.6 | 158.1 | 81 | 49 |
576.8 | 86 | 49 | ||
交沙霉素 | 828.3 | 174.3 | 121 | 45 |
109.3 | 126 | 45 | ||
吉他霉素 | 772.4 | 215 | 116 | 41 |
174.1 | 121 | 41 | ||
噁喹酸 | 262 | 244 | 41 | 27 |
216 | 41 | 41 | ||
氟甲喹 | 262 | 244 | 41 | 27 |
202 | 41 | 45 | ||
萘啶酸 | 233 | 215 | 40 | 19 |
187 | 40 | 35 | ||
磺胺吡啶 | 250 | 156 | 65 | 24 |
184 | 65 | 24 | ||
磺胺氯哒嗪 | 285 | 156 | 50 | 23 |
108 | 50 | 35 | ||
磺胺甲嘧啶 | 265 | 156 | 60 | 25 |
172 | 60 | 25 | ||
磺胺甲噻二唑 | 271 | 156 | 50 | 20 |
107 | 50 | 32 | ||
磺胺甲氧哒嗪 | 281 | 156 | 70 | 25 |
215 | 60 | 25 | ||
磺胺对甲氧嘧啶 | 281 | 156 | 70 | 25 |
108 | 70 | 35 |
注：加下划线的即为定量离子对
结果与讨论
实验结果
由表3、4可知，采用固相萃取结合高效液相串联质谱法检测水中抗生素。SPE实验中，只有红霉素实验数据偏低；LDC实验中，噁喹酸回收率偏高，其余回收率均在65% ~ 112%。由图1、2、3、4可看出经PEP-2填料净化效果良好，采用Venusil MP C18色谱柱检测得到的抗生素峰形良好，且保留时间稳定。
表3. LDC(PEP-2)大体积水专用柱做水中抗生素加标回收实验结果(添加水平0.02 μg/L)
物质名称 | 平均回收率/% | RSD/% | 保留时间/min |
红霉素 | 83.7 | 24.7 | 5.91 |
交沙霉素 | 77.0 | 61.1 | 6.19 |
吉他霉素 | 73.6 | 25.8 | 6.05 |
噁喹酸 | 136.1 | 17.4 | 7.11 |
氟甲喹 | 111.8 | 10.4 | 6.58 |
萘啶酸 | 103.2 | 5.4 | 7.08 |
磺胺吡啶 | 96.4 | 9.9 | 5.65 |
磺胺氯哒嗪 | 99.1 | 11.1 | 6.31 |
磺胺甲嘧啶 | 81.6 | 8.7 | 5.81 |
磺胺甲噻二唑 | 105.2 | 13.8 | 5.98 |
磺胺甲氧哒嗪 | 107.7 | 12.8 | 6.01 |
磺胺对甲氧嘧啶 | 109.5 | 7.0 | 6.19 |
表4. SPE（PEP-2）小柱做水中抗生素加标回收实验结果(添加水平0.02 μg/L)
物质名称 | 平均回收率/% | RSD/% | 保留时间/min |
红霉素 | 55.2 | 27.5 | 5.91 |
交沙霉素 | 70.8 | 3.0 | 6.19 |
吉他霉素 | 82.6 | 13.6 | 6.05 |
噁喹酸 | 66.7 | 10.2 | 7.11 |
氟甲喹 | 88.4 | 3.4 | 6.58 |
萘啶酸 | 96.7 | 8.0 | 7.08 |
磺胺吡啶 | 90.3 | 7.3 | 5.65 |
磺胺氯哒嗪 | 97.9 | 7.1 | 6.31 |
磺胺甲嘧啶 | 79.9 | 3.8 | 5.81 |
磺胺甲噻二唑 | 87.0 | 1.6 | 5.98 |
磺胺甲氧哒嗪 | 86.9 | 7.4 | 6.01 |
磺胺对甲氧嘧啶 | 90.2 | 4.6 | 6.19 |
实验谱图
图1. 0.01 μg/mL混合标准工作溶液正离子模式LC/MS/MS色谱图
图2.基质空白正离子模式LC/MS/MS色谱图
图3. 0.01 μg/mL基质混合标准工作液正离子模式LC/MS/MS色谱图
图4. 0.02 μg/L基质加标正离子模式LC/MS/MS色谱图
结论
本实验建立了水中抗生素的固相萃取方法并结合LC/MS/MS对加标量为0.02 μg/L进行了检测，并进行了SPE柱与LDC专用柱的对比。经实验数据分析，两者无明显差异，但LDC的实验操作更加方便快捷，利于检测水中抗生素的残留量。
附：相关产品
产品名称 | 规格描述 | 包装数量 | 订货号 |
Venusil MP C18 | 5 μm，100 ?，2.1 × 150 mm | 1支 | VA951502-0 |
LDC 大体积水处理柱-Cleanert PEP-2 | 1 g/200 mL | 4支/pk | LPE000100-2 |
大体积水处理负压设备 | 2通道 | — | SPE-D6 |
保护柱套 | 适用于4.6 × 10 mm和2.1 × 10 mm | 1支 | SH-100 |
直联式保护柱芯 | 5 μm，100 ?；2.1 × 10 mm | 4支/包 | VA950102-0S |
1.5 mL样品瓶 | 短螺纹透明带书写处 32 × 11.6 mm | 100/pk | 1109-0519 |
1.5 mL样品瓶盖 | 9 mm中心孔蓝盖，红色橡胶/米色PTFE隔垫 45°Shore A; 1.0 mm | 100/pk | 0915-1819 |
针式过滤器 | 单膜，13 mm，0.22 μm | 200个/包 | AS021320 |
一次性注射器 | 2 mL无针头 | 100支/包 | LZSQ-2ML |
甲醇 | 4 L/瓶，色谱纯 | 4 × 4 L/箱 | AH230-4 |
乙腈 | 4 L/瓶，色谱纯 | 4 × 4 L/箱 | AH015-4 |